靶向蛋白质组学弥补基因检测的不足,为肿瘤患者带来更多希望

发表于 2020-06-26

参考文献:Serna G, Ruiz-Pace F, Cecchi F, et al. Targeted multiplex proteomics for molecular prescreening and biomarker discovery in metastatic colorectal cancer[J]. Scientific reports, 2019, 9(1): 1-10.(IF = 4.1

出版时间:2019年9月19日

DOI:10.1038/s41598-019-49867-7

作者单位:西班牙瓦尔德希布伦肿瘤研究所,云检医学美国研发中心等



蛋白生物标记物广泛用于癌症的诊断、预后和治疗效果的预测。本文使用靶向多重蛋白质组学(TMP)作为工具,同时检测转移性结直肠癌(mCRC)患者中涉及致癌、肿瘤抑制、药物代谢和耐药性的54种蛋白质,结果显示了结直肠癌的肿瘤间异质性在个别样本中有独特的蛋白质改变,可以指导临床试验、生物标记物和药物开发。同时本研究也充分证明了选择反应监测质谱(SRM-MS)靶向蛋白质组学是基因检测的有效补充。

云检医学为此研究提供多重靶向蛋白质组学检测技术,客观定量、灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于肿瘤患者用药指导。

引言:

   在描述性和预测性生物学研究中,同时准确检测出样本中多种蛋白质非常重要,包括全谱蛋白质组学,蛋白质作用网络研究,基因组改变的验证和临床生物标志物的开发等。

    免疫组化(Immunohistochemistry, IHC) 基于抗原与抗体特异性结合原理,是蛋白质检测公认的“金标准”。抗体-抗原结合可以在多种基质中发生,如流体、细胞表面、细胞或组织内以及器官中。IHC是基于组织的蛋白生物标志物分析使用最广泛的平台,它可在保持组织结构的同时进行蛋白质的检测。尽管IHC操作简单且价格便宜,但它只能进行半定量检测,不能进行蛋白质的综合分析,且重现性差、通量低。

    选择反应监测质谱(Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry, SRM-MS)靶向蛋白质组学已经成为一种有前景且高度灵敏的检测方法,用于在无抗体的情况下定量同一组织样品中的多种蛋白质。福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)是临床肿瘤样品的标准保存方法,但由于样本中蛋白质不完全溶解从而阻碍了SRM-MS技术在FFPE组织中的应用,本研究通过Liquid Tissue®技术解决了这一难题。

    研究结果显示,结直肠癌的肿瘤间异质性在个别样本中有独特的蛋白质改变,可以指导临床试验、生物标记物和药物开发。此研究期望扩大多靶向蛋白质组学panel(Targeted Multiplex Proteomics Panel, TMP panel)的蛋白标志物检测范围,为ADC和免疫抑制剂药物治疗提供指导。




01


研究背景:

    本研究中,使用Liquid Tissue®蛋白质组学方法逆转福尔马林诱导的交联,从而使样品中的所有蛋白质完全溶解以进行精确定量。采用多重选择反应监测(SRM)方法检测50例接受过基因组测序的转移性结直肠癌(mCRC)患者组织中的54种蛋白质,这些蛋白质分别与肿瘤发生、肿瘤抑制、药物代谢、耐药相关,并从以下三个方面进行研究和探索:  

    ● 蛋白表达水平和临床病理、基因组检测结果的相关性;  

    ● 靶向治疗与化疗联合抗EGFR治疗效果的相关性;

    ● SRM-MS用于临床试验患者检测潜在生物标志物的价值和意义。


以下为患者疾病及治疗情况


年龄,中位数(范围)年

57.9 (28–73)

性别

32 (64%)

18 (36%)

位置

左结肠

31 (62%)

右结肠

7 (14%)

直肠

7 (14%)

其他

5 (10%)

诊断时转移部位

0

17 (34%)

>0

33 (66%)

RAS 状态

KRAS 突变型

20 (40%)

NRAS 突变型

1 (2%)

RAS 野生型

29 (58%)

PIK3CA 状态

突变型

6 (12%)

野生型

44 (88%)

组织

原发性肿瘤

26 (52%)

肝转移

24 (48%)

一线化疗

伊立替康 + 5FU

14 (28%)

奥沙利铂 + 5FU

16 (32%)

奥沙利铂 + 5FU + 抗EGFR

8 (16%)

伊立替康 + 5FU + 抗EGFR

9 (18%)

其他

3 (6%)

二线化疗

伊立替康 + 5FU

22 (44%)

奥沙利铂 + 5FU

5 (10%)

奥沙利铂 + 5FU + 抗EGFR

2 (4%)

伊立替康 + 5FU + 抗EGFR

13 (26%)

抗EGFR

1 (2%)

无治疗

7 (14%)

生存时间,中位数(95%置信区间)个月

转移状态下的生存期

44.3 (40–58)

疾病进展与一线治疗后时间间隔

8.3 (7–11)

疾病进展与二线治疗后时间间隔

6.9 (6–9)

                                                                      表1:患者信息


02


研究结果:


■ 靶向蛋白质组学可作为基因检测的补充和制定治疗方案的依据

    

    本研究的主要目标之一是通过鉴定没有任何靶向基因组改变的患者中蛋白质的异常表达,用以探索多重蛋白质组学分析是否可以补充当前的基因组分子预筛选。

    结果发现在49例患者中,6例(12%)存在PIK3CA 9或20号外显子突变(同时也属于KRAS突变型),可接受PI3K抑制剂联合治疗。另外43例基因组检测阴性的患者,经SRM-MS检测发现,20例(47%)患者没有PTEN蛋白表达。1例患者EGFR蛋白高表达(7635amol/μg),4例患者HER2蛋白高表达(同时由IHC验证),没有检测到存在cMET蛋白表达的患者。在21例患者中,发现存在29个(93.5%)蛋白表达异常,但基因组水平上未检测到靶向基因组水平改变。其中12例可选择ADC药物治疗方案(GPNMB、MSLN和TROP2)或改变化疗方案(TOPO1和TOP2A)。总体而言,在43例基因组检测阴性的患者中,有28例患者(65%)由于靶向蛋白质组分析(PTEN、EGFR、HER2、GPNMB、MSLN、TROP2、TOPO1或TOP2A出现)预测标记呈阳性,符合临床试验入组条件。



1.jpg

■ mCRC中靶向多重蛋白质组学的探索性表达分析


    为获得没有周围微环境的纯肿瘤细胞群,采用激光捕获显微切割技术对组织切片中的肿瘤细胞进行精准切割,再使用Liquid Tissue®技术将分离的肿瘤细胞裂解成多肽,通过SRM-MS对蛋白质进行定量检测。在分析的54种靶蛋白中,有18种(33%)低于SRM-MS的检出限(不可检出),如FGF受体(FGFR1-3),IGF1R,HGF和PDL1在至少一个样品中检测到36种蛋白质(67%)。

2.jpg


    TMP panel中包括了7个常规用IHC检测的蛋白,分别为:

    细胞角蛋白:KRT5和KRT7

    层状上皮标志物:P63蛋白

    间充质蛋白:Vimentin

    神经内分泌分化蛋白:CHGA、SYP

    甲状腺转录因子:TTF1

    有2例患者存在TTF1和P63表达:其中一例患者ID-87表达P63,同时高表达EGFR和KRT7,高度提示鳞状细胞分化。组织病理学显示该病例为肛门鳞状细胞癌,因此此样本不纳入进一步临床试验研究。

    另外一例ID-51肝转移患者,表达TTF1TTF1是一种高度敏感和特异的肺腺癌诊断标志物,随后IHC检测显示TTF1阳性,KRT20阳性和KRT7阴性。


■ RAS突变型和野生型肿瘤中蛋白的表达


    RAS突变是mCRC中的重要指标,通过检测RAS突变型(n =21.43%)与野生型病例(n = 28.57%)中蛋白质水平的差异,发现与野生型相比,RAS突变亚组中的KRAS和EGFR表达水平较高,TOPO1和TOP2A的表达明显较低。

类别

RAS野生型

(n = 28, 57%)

RAS突变 

(n = 21,43%)

EGFR蛋白浓度

867 amol/μg

1192 amol/μg

KRAS蛋白浓度

192 amol/μg

232 amol/μg

TOPO1A

1033 amol/μg

1408amol/μg

TOPO2A

441 amol/μg

753 amol/μg

                                        表2 RAS突变型和野生型肿瘤中蛋白的表达


■ 靶向多重蛋白质组学发现间皮素MSLN作为mCRC预后标志物


    本研究发现在49例mCRC中,19例(30%)存在MSLN蛋白的表达。SRM-MS和IHC检测皆显示MSLN高表达提示患者OS较差,是预测转移环境中OS恶化的独立因素。


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 ■ 蛋白质表达水平可作为靶向治疗临床获益的预测指标


    23例RAS野生型患者接受了抗EGFR一线或二线治疗,结果发现,PTEN蛋白缺乏与接受抗EGFR一线治疗疾病进展显著相关,PTEN蛋白缺乏的患者疾病进展时间为一线治疗后的4.2个月,而PTEN蛋白表达的患者疾病进展时间为9.4个月。



03


讨论与总结:


1、基于基因组测序或IHC检测技术,转移性mCRC招募入组率不超过15%,蛋白质组学指导为有资格入组临床研究的患者提供更多的治疗选择,特别是越来越多的ADC和免疫治疗临床试验

2、提示新的预后标志物和治疗靶点:TMP分析发现MSLN在30%的转移性结直肠癌中表达。

MSLN是一种细胞表面糖蛋白,其在正常人组织中仅表达于间皮细胞,但在许多实体肿瘤(间皮瘤、胰腺癌、胃癌和卵巢癌等)中高表达,是ADC药物的一个有价值的潜在靶点。在mCRC中,MSLN表达的价值尚未深入研究,在文献中已有报道,MSLN与预后不良相关,进一步证实了该蛋白在mCRC中的生物学作用。

3、证实了RAS野生型患者中PTEN蛋白缺乏与接受抗EGFR一线治疗疾病进展显著相关。

以前的回顾性研究表明,这种相关性很可能与PTEN对患者的预后影响有关。

4、对蛋白质组学数据的探索性分析使我们能够评估该方法在mCRC患者的分子诊断评价中的应用。

TMP可能会补充常规组织病理诊断的不足,发现误诊病例,有助于临床医生选择合适的治疗方案。例如,结合TMP结果发现了1例神经内分泌分化肿瘤。

研究分析发现,原发和转移病灶蛋白表达没有明显的差异,虽然转移性肿瘤也许存在新的获得性变异,但原发性肿瘤的分子分型也可用于转移性肿瘤治疗决策。

综合蛋白质组学分析也可能揭示临床分子分型中的生物学差异,如RAS突变型与野生型CRC相比,KRAS突变型蛋白表达水平显著升高。



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