Nature :3型BRAF突变肿瘤对RAS活化的阻断剂敏感,判断BRAF突变型有助于癌症患者的用药选择

发表于 2020-06-26

参考文献Yao Z , Yaeger R , Rodrik-Outmezguine V S , et al. Tumours with class 3 BRAF mutants are sensitive to the inhibition of activated RAS[J]. Nature, 2017, 548(7666):234.(IF=43.1

出版时间:2017年8月2日

DOI:10.1038/nature23291

作者单位:纪念斯隆·凯特林癌症中心分子药理学项目组云检医学美国研发中心等


    根据活化机制的不同,致癌BRAF突变体可分为三类,它们对抑制剂的敏感性不同。BRAF 1型突变(BRAFV600突变)不依赖于RAS,以单体形式传导信号,并仅对当前RAF“单体”抑制剂敏感。BRAF 2型突变不依赖于RAS,以功能性二聚体形式传导信号,且对维罗非尼耐受。本文将低激酶活性或失激酶活性的BRAF突变定义为BRAF 3型突变。这些突变体依赖RAS并且对依赖ERK反馈的RAS敏感。他们通过增强其与RAS的结合激活ERK,并需要分子共存机制使肿瘤中的RAS活化才能起作用。因此,他们并非独立的驱动因素,其作用相当于由RAS突变、NF1丢失或受体活化引起的RAS信号的放大器。在黑色素瘤中,BRAF 3型突变与RAS的突变和NF1的突变共存,这些患者可采用MEK抑制剂治疗。然而,大多数上皮细胞肿瘤中的3型突变与RAS/NF1改变无关,使用包括可驱动RAS活化的RTKs抑制剂在内的联合治疗可能效果更佳。

    云检医学为此研究提供了先进的高通量质谱检测服务,通过检测肿瘤组织中的靶向蛋白标志物,可以为肿瘤患者提供精准的靶向治疗、化疗和免疫治疗用药指导。


引言:

    BRAF编码RAF激酶蛋白,其属于RAS-RAF-MEK-ERK,即MAPK/ERK信号通路,该通路对细胞的生长、增殖、分化、迁移和凋亡的调节十分重要。多种受体酪氨酸激酶RTK(如EGFR等)可活化RAS从而激活整条信号通路发挥生物功能。BRAF是MEK/ERK最为关键的激活因子。BRAF突变是不少恶性肿瘤的常见发病原理。在正常情况下,RAF蛋白会根据其所收到的信号来控制下游信号通路的活动与细胞生长。当BRAF发生致病性突变时,可导致RAF蛋白处于持续激活状态,在未接收到化学信号时也持续对其下游通路传导信号,导致细胞不受控制地生长与增殖。



研究结果

01


什么是3型BRAF突变

   

    ●对ERK介导的反馈敏感    

    相较于活性突变如V600E、K601E和G469A,失酶活突变D594G/N和低酶活突变G466V/E也可以增加p-MEK和细胞周期蛋白1,只是不如前者的激活作用显著(图1a)。在携带HRAS Q61K突变和低酶活性BRAF G466E突变的黑色素瘤细胞株SK-MEL-208及携带低酶活性BRAF G466V突变的非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer, NSCLC)细胞株H1666中,将BRAF基因敲除后再重新引入低酶活性的突变型或野生型,发现相较于引入野生型,引入低酶活性突变型才能够使ERK重新激活(图1b)。这些突变对ERK负反馈敏感,即相当于反过来激活了RAS。


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▲ 图1


     ●RAS依赖型信号传导   

    与已知的BRAF活性突变不同,BRAF失活突变不能降低RAS-GTP,提示其是以RAS依赖型方式进行信号转导。本文列举了31种人类肿瘤中不同的BRAF突变型,其中16种为低酶活性或失酶活性的突变型(表1),均为RAS依赖型。

BRAF突变型

激酶活性

RAS依赖性

二聚体依赖性

对维罗非尼的敏感性

1型

野生型

中性

不敏感

V600E

敏感

V600K

敏感

V600D

敏感

V600R

敏感

V600M

中等

敏感

2型

K601E

不敏感

K601N

不敏感

K601T

不敏感

L597Q

不敏感

L597V

中等

不敏感

G469A

不敏感

G469V

不敏感

G469R

中等

不敏感

G464V

中等

不敏感

G464E

中等

不敏感

其他融合蛋白如KIAA1549-BRAF

不敏感

3型

D287H

不敏感

V459L

不敏感

G466V

不敏感

G466E

不敏感

G466A

不敏感

S467L

不敏感

G469E

不敏感

N581S

不敏感

N581I

不敏感

D594N

不敏感

D594G

不敏感

D594A

不敏感

D594H

不敏感

F595L

不敏感

G596D

不敏感

G596R

不敏感

▲ 表1

    通过24,000例黑色素瘤分析发现,携带有低酶活性或失酶活性突变型BRAF的肿瘤中,一般也携带RAS失调的基因损伤如NF1缺失/突变或RAS突变,而BRAF活性突变没有RAS失调的现象(图2)。在非小细胞肺癌和结直肠癌中失活突变却少有NF1缺失/突变或RAS突变的现象(图2)。


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▲ 图2


    进一步对肺癌和结直肠癌的三种BRAF失活突变的细胞株NSCLC H1666 (BRAF(G466V)), NSCLC CAL-12T (BRAF(G466V)) 和CRC H508 (BRAF(G596R))进行研究,结果发现了RTKs的磷酸化,如胰岛素、IGF1R受体、MET、ERBB2和EGFR,其中EGFR在此三种细胞株中均被发现。且RAS活化、ERK信号传导和细胞增殖均对EGFR抗体西妥昔单抗敏感(图3和图4)。但在低酶或失酶活突变的黑色素瘤细胞株SK-MEL-208中,RTK活化水平较低,且对EGFR抗体西妥昔单抗不敏感(图3和图4)。因此,RAS是否被活化可作为区分BRAF突变的依据。


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 ▲ 图3


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▲ 图4


     携带BRAF 3型突变的黑色素瘤亦发生RAS突变或NF1缺失。携带BRAF 3型突变的肺癌和结直肠癌中,少有RAS突变或NF1缺失发生,通常由受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase, RTK)激活RAS,因此这类肿瘤对通过抑制RTK而实现RAS活化的阻断剂敏感。



02


低酶活和失酶活的BRAF突变有相似的功能特性


    低酶活和失酶活的BRAF突变有相同的特性,即以RAS依赖型方式活化ERK,且依赖RAS负反馈而活化ERK。因此,为区别于非RAS依赖型的BRAF 1型和2型活化突变,将此类突变命名为BRAF 3型突变。

    野生型BRAF的过表达可增强MEK和ERK的磷酸化,BRAF 3型突变具有更大的增强磷酸化能力。BRAF 3型突变比野生型BRAF与RAS-GTP的结合力更强,能够进一步加强CRAF,导致ERK通路信号增强。其可增强BRAF而非CRAF和突变NRAS的结合,且BRAF 3型突变-野生型CRAF二聚体的形成多于野生型BRAF-CRAF二聚体(图5和图6)。说明ERK信号与BRAF3型突变-野生型CRAF的二聚体形成相关。

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▲ 图5

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▲ 图6



03


BRAF 3型突变患者的用药指导


    通过抑制ERK信号传导,MEK阻断剂曲美替尼可抑制携带有BRAF 3型突变的肿瘤细胞增殖(图7a),但其毒副作用可能影响其应用于肿瘤的治疗。由于3型BRAF突变肿瘤中既包括BRAF突变-野生型RAF异二聚体,又包括野生型RAF二聚体,所以RAF阻断剂维罗非尼不能有效抑制此类肿瘤的ERK通路,因此不是有效的治疗药物(图7b,c)。表1中列举了此类对维罗非尼不敏感的突变类型。因此此类RAS突变或NF1缺失引起的RAS活化肿瘤中,使用维罗非尼治疗效果不佳。

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▲ 图7

    但在大多数3型突变的肺癌、结直肠癌和其他上皮细胞癌中,RAS活化并非是RAS突变或NF1缺失引起的,而有其他机制,如RTK的活化。

    本文给予携带BRAF(G466V)、野生型RAS和NF1的结直肠癌患者(表2)EGFR单抗帕尼单抗和伊立替康治疗5个月后,原2.9✖2.1cm的肝损伤消失,肿瘤消退(图8)。PDXs对西妥昔单抗治疗敏感,肿瘤完全消退,对维罗非尼不敏感,而曲美替尼则能延缓肿瘤生长。同基因型的PDX同样对西妥昔单抗敏感,可使肿瘤完全消退,对维罗非尼不敏感,而曲美替尼无效(图8)。


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▲ 图8

突变类型

基因名称

DNA变化

蛋白变化

错义突变

BRAF (NM_004333)

c.1397G>T

p.G466V

TP53 (NM_000546)

c.481G>T

p.A161S

APC (NM_000038)

c.4461_4464delTATT

p.L1488fs

c.2379_2380delAA

p.S794fs

BARD1 (NM_000465)

c.709C>T

p.Q237X

FLCN (NM_144997)

c.323G>T

p.S108I

LATS1 (NM_004690)

c.860G>A

p.R287Q

MITF (NM_198159)

c.5A>C

p.Q2P

MYCL1 (NM_001033082)

c.128A>G

p.Y43C

缺失突变

TGFBR2 (NM_001024847)

删除

表达减少

MAP2K4 (NM_003010)

基因内缺失

表达减少

PARK2 (NM_004562)

基因内缺失

表达减少

PIK3R1 (NM_181523)

基因内缺失

表达减少

▲ 表2


    另一例切除此卵巢病变的肾转移性集合管癌(CDC)患者对联合化疗有反应。原发性肿瘤和卵巢转移的PDX均携带BRAF 3型(G466A)突变,无RAS突变、RTK突变和NF1缺失。质谱分析法显示出肿瘤中MET和EGFR的高水平表达。在PDX源细胞中,RAS活化和ERK信号对MET抑制剂(克里唑蒂尼, INC280)敏感,但是对西妥昔单抗不敏感,这说明MET是此类肿瘤中RAS活性的主导驱动因素。ERK信号和细胞生长对MET(INC280)和MEK(曲美替尼)抑制均敏感,两者联合使用后更有效(图9)。

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▲ 图9



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